تولید کپسید پروتئینی ویروس موزائیک خیار در باکتری e. coli به منظور تولید آنتی بادی نوترکیب

ویروس موزاییک خیارcucumber mosaic cucumovirus (cmv) از خانواده bromoviridae یکی از مهمترین ویروس های بیمارگر کدوییان می باشد. جنس cucumovirus از خانواده bromoviridae دارای سه عضو، ویروس موزائیک خیار ((cmv، ویروس بی بذری گوجه فرنگی ((tav و ویروس کوتولگی بادام زمینی (psv) می باشد. cmv با پراکنش جهانی، وسیع ترین دامنه میزبانی را در بین ویروس های گیاهی داشته که در مزارع ایران نیز شیوع دارد و باعث کاهش راندمان محصول تا بیش از یک سوم می شود. استرین های ویروس موزائیک خیار در دو گروه بزرگ (? و ??) قرار می گیرند که بر اساس اطلاعات سرولوژیکی، هیبریداسیون، توالی نوکلئوتید و اطلاعات پروتئین پوششی توصیف می شوند. این دو گروه در حدود 75% توالی نوکلئوتیدی با همدیگر مشابهت نشان می دهند، این در حالیست که این استرینها در همان زیر گروه 97%-99% در توالی نوکلئوتیدی مشابهت دارند. این ویروس ها دارای ژنوم چند بخشی شامل سه قطعه آر. ان. ای تک رشته ای و آر. ان. ای های زیر ژنومی می باشند. rna1 بعنوان بزرگترین قطعه بوده و دارای 3357 نوکلئوتید و پروتئین 1a را کد می کند. rna2 حاوی 3050 نوکلئوتید و پروتئین 2aرا کد می کند. پروتئین های 1aو 2a برای همانند سازی آر. ان. ای ویروسی ضروری هستند.rna3 حاوی حدود 2200 نوکلئوتید و دارای دو سیسترون می باشد پروتئین 3a توسط orf قرار گرفته در مجاورت ?5 رمز می شود این پروتئین برای حرکت سلول به سلول در میزبان مورد نیاز است. دومین orf موجود درrna3، پروتئین پوششی (kda24) را کد می کند که در طرف ´3 مولکول rna3 قرار گرفته واز طریقrna4 زیر ژنومی کد می شود. هدف این تحقیق بیان ژن پروتئین پوششی ویروس موزائیک خیار در باکتریescherichia coli بدون نیاز به خالص سازی ویروس بود. تولید پادتن نوترکیب، نیاز به خالص سازی ویروس را که مستلزم وجود الترا سانتریفوژ است، مرتفع می سازد. به منظور تولید پروتئین پوششی نوترکیب، قاب خواندنی شماره چهار (rna4)، rna سوم ویروس که پروتئین پوششی را رمزگردانی می کند به کمک دو آغازگر اختصاصی از روی cdnaکامل ویروس توسط pcrتکثیر و به حامل همسانه سازی (ptz57r/t) متصل و در باکتریe. coli dh5 کلون شدند باکتری های ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب برروی محیط کشت lb حاوی آمپی سیلین، iptg و x-gal غربال شدند و پلاسمید از آنها به روش لیز آلکالینی استخراج گردید. پلاسمید های استخراج شده با آنزیم های bam hiو sac i با محل اثر در دو طرف محل اتصال دی ان ای خارجی برش داده شدند، قطعه ی مورد نظر افزایش و به حامل بیان pet22b(+) اتصال داده شد بود. پس از بیان پروتئین پوششی cmv در e. coli rosseta اندازه ی آن در sds-page بررسی شد. وزن مولکولی این پروتئین در حدود 24 کیلو دالتون که منهای تعداد اسیدآمینه های افزوده شده توسط حامل، با اندازه ی پروتئین پوششی cmv مطابقت داشت.